В 1979 году окончила Университет Санта-Клары (Калифорния) со степенью бакалавра политологии summa cum laude, была принята в Phi Beta Kappa. В 1983 году получила степень доктора права (J.D.) в юридической школе Университета Виргинии. После учёбы занялась юридической деятельностью.
В 1993 году Билл Клинтон назначил её на пост федерального прокурора США в Аризоне, а с 1999 по 2002 год она являлась главным прокурором штата. В 2002 году Наполитано победила на выборах губернатора Аризоны; в 2006 году она была переизбрана на эту должность. На этом посту она придерживалась центристских взглядов. Наполитано уделяла особое внимание вопросам образования, уровню заработных плат преподавателей, а также боролась с нелегальной иммиграцией. Если к началу её губернаторской деятельности дефицит бюджета штата составлял около миллиарда долларов, то к 2006 году он стал уже профицитным и составил около 300 миллионов долларов. В 2005 году журнал Time включил её в число пяти лучших губернаторов США[5].
В конце 2008 года Барак Обама объявил о назначении Наполитано на должность министра национальной безопасности США[6]. 20 января 2009 года Сенат утвердил её кандидатуру; в тот же день она сняла с себя полномочия губернатора Аризоны. В новую должность она официально вступила на следующий день — 21 января, занимала этот пост по 6 сентября 2013 года.
С 30 сентября 2013 года по 1 августа 2020 года являлась президентом Калифорнийских университетов.
Также с 2014 года работает на постоянном контракте в штате Goldman School of Public Policy[англ.] Калифорнийского университета в Беркли.
Член Американской академии искусств и наук (2015).
В мае 2022 года Наполитано была назначена членом Президентского консультативного совета по разведке.
Удостоена Thomas Jefferson Foundation Medal in Law (2010).