Внутри клеток глюкозо-6-фосфат образуется путём фосфорилирования глюкозы в положении 6. Катализатором реакции в большинстве случаев является фермент гексокиназа; в некоторых случаях, например, в клетках печени высших млекопитающих — глюкокиназа. Во время реакции потребляется одна молекула АТФ.