Реактив Эллмана или 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота) (ДТНБ)[1] — химическое соединение, используемое для количественного анализа тиоловых групп в образце[2]. Широко используется в биохимии для определения содержания цистеинов в белках и пептидах. Метод был предложен Джорджем Л. Эллманом в 1959 году[3].
В оригинальной статье Эллмана[2] описывается, что он приготовил этот реактив, окислив 2-нитро-5-хлорбензальдегид до карбоновой кислоты, и ввёл тиоловую группу через сульфид натрия, а затем соединил два мономера, окислив их йодом. В наше время этот реактив можно приобрести в готовом виде.
Тест Эллмана
При реакции сульфгидрильных (тиоловых) групп с реактивом Эллмана происходит разрыв дисульфидной связи в реактиве, и образуется 2-нитро-5-тиобензойная кислота, которая легко переходит в хиноидную форму в воде при нейтральных и щелочных рH и имеет ярко-жёлтую окраску.
Реакция ДНТБ с тиолом (R-SH).
Реакция протекает быстро и со стехиометрией один к одному. Образовавшийся продукт в хиноидной форме (тионитрофильный анион) обладает сильным поглощением при 412 нм и может количественно определяться при помощи спектрофотометра. Для разбавленных буферных растворов используется молярный коэффициент экстинкции 14,150 M1 см1[4][5], а для растворов с высокой концентрацией солей, например в растворе 6-ти молярного гуанидин хлорида или мочевины — 13,700 M1 см1[5]. К несчастью, в оригинальной работе 1959 года коэффициент экстинкции для разбавленных растворов был занижен до 13,600 M1 см1, и эта ошибка со временем закрепилась в литературе[3]. Коммерческий ДТНБ не всегда полностью чист, поэтому для получения точных и воспроизводимых результатов его следует перекристаллизовать[5].
Реактив Эллмана позволяет измерить концентрации низкомолекулярных тиолов, таких как глутатион, при этом производить измерения можно как в чистом растворе так и в биологическом образце, например в крови[6].
Реактив Эллмана используют при определении активности глутатионпероксидазы; при этом для измерения активности изоферментов с широкой тиоловой специфичностью может быть использован не только глутатион, но также цистеин и гомоцистеин, благодаря равноэффективности реактива Эллмана для определения концентрации любого из тиолов.[7]
12Riener C. K., Kada G., Gruber H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4'-dithiodipyridine (англ.) // Anal Bioanal Chem[англ.] : journal. — 2002. — Vol. 373, no. 4—5. — P. 266—276. — doi:10.1007/s00216-002-1347-2. — PMID12110978.
Collier H. B. Letter: A note on the molar absorptivity of reduced Ellman's reagent, 3-carboxylato-4-nitrothiophenolate (англ.) // Anal. Biochem.[англ.] : journal. — 1973. — Vol. 56, no. 1. — P. 310—311. — doi:10.1016/0003-2697(73)90196-6. — PMID4764694.
Sedlak J., Lindsay R. H. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent (англ.) // Anal. Biochem.[англ.] : journal. — 1968. — Vol. 25, no. 1. — P. 192—205. — doi:10.1016/0003-2697(68)90092-4. — PMID4973948.
